VELP OXITEST氧化稳定性分析仪:创新的加速氧化分析仪技术，根据AOCS Cd-12c-16测定含油脂样本的氧化稳定性。使用OXITEST反应器进行的氧化稳定性测试可加速脂质的氧化过程，在正常条件下，氧化过程可持续数周或数月，为食品和饲料、化妆品、制药和石化行业提供快速、准确和可靠的结果。

近期四川大学生物科学与工程学院的研究团队在MDPI发布了一篇使用VELP OXITEST氧化稳定性分析仪做研究论文，我们一起来看看发布在MDPI的内容。

基于UPLC-Q-TOF-MS的脂质组学研究比较不同类型花生品种的脂质含量

黄玉婷1，马瑞1，徐永菊2，钟凯1，钱卜3，洪高1，*

1四川大学生物科学与工程学院，成都610065;hyt8085@163.com(Y.H.);marui8003@163.com(R.M.);eric211@163.com(K.Z.)

2四川省农业科学院农作物研究所，成都610300;xyj2002024@163.com

3四川大学华西公共卫生学院，成都610065;buqian7978@scu.edu.cn

*通讯：gao523@hotmail.com

摘要：花生是脂肪丰富的膳食来源，对人体健康至关重要。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS分析了13个花生品种的脂质含量。OXITEST反应器用于测试其脂质氧化稳定性。共检测到27个亚类，229个单独的脂质。脂质和氧化稳定性的组合分析显示脂质不饱和度与氧化稳定性呈负相关。此外，不同花生品种的脂质谱差异显着。总共11种脂质分子(TG 18:2/18:2/18:2，TG 24:0/18:2/18:3，TG 20:5/14:1/18:2，TG 18:2/14:1/18:2，PE 17:0/18:2，BisMePA 18:2/18:2，PG 38:5，PMe 18:1/18:1，PC 18:1/18:1，MGDG 18:1/18:1，TG 10:0/10:1/18:1)可用作鉴定高油酸(OA)和非高OA花生品种的可能指标，基于VIP值大于2的脂质分子的PLS-DA结果。综合分析有助于花生品种的合理选择和应用。

关键词：花生;油酸;脂质组学;氧化稳定性

1、简介

花生(Arachis hypogaea L.)是世界上种植广泛的油料作物之一。它富含脂质，蛋白质和氨基酸，用于生产花生油和花生酱[1-4]。由于致力于食用健康食品，许多花生品种，特别是高油酸(OA)花生品种已经开发出来。消费高OA花生，这是(证明)高度有益的抗氧化剂，可能有助于减少氧化应激引起的疾病。目前的证据支持OA与胃损伤[5]，心肌损伤，心血管胰岛素抵抗和内皮功能障碍的健康管理之间的积极联系[6]。然而，目前还缺乏对不同花生品种品质的比较分析。因此，鉴于高OA花生品种和其他功能性花生的数量不断增加，确定不同品种的质量至关重要。

近年来，研究人员越来越关注食品质量分析，采用不同的分析方法。油料作物的质量取决于含油量[7]，皂化值和酸值[8]。这些方法只是评估油料作物的质量;因此，它们是有限的，因为它们不包括成分分析。随后，广泛采用脂肪酸组成分析来评估食品质量。然而，该方法不能用于分析单一脂质种类。在这项研究中，选择脂质组学这项相对较新的技术来研究研究样品中完整脂质分子的定性和定量特征[9,10]。Q Exactive是开发的技术，具有极高的分辨率，灵敏度和质量精度。它将高选择性四极杆的离子过滤与Orbitrap高分辨率质量数(HR/AM)测量技术相结合，为碎片离子扫描提供强大的功能[11]。刘浩等人研究了种子发育过程中6个时间点高OA种子脂质分子种类的动态变化和花生品种的全球基因表达谱[12,13]。Rabiatu-Bonku等人分析了花生的健康方面作为其化学成分的结果[14]。有必要比较高OA和非高OA花生之间的脂质含量。

脂质的氧化稳定性是油料作物加工产品重要的性质之一。它影响风味，营养和保质期。目前，已经开发了几种测量这些油料作物加工产品氧化态的技术，如差示扫描量热法(DSC)[15]，压力DSC(PDSC)[16]和电子自旋共振(ESR)[17。OXITEST反应器(Velp Scientifica，Usmate，Milan，Italy)可用于氧化稳定性分析。它是一种使样品经受高氧化应激(高温和氧气超压)并在短时间内评估样品氧化状态的仪器。OXITEST反应器是可靠的，可以直接分析固体，液体和面团食品，而无需首先分离脂肪部分[18]。

本研究的主要目的是分析和比较13种不同花生品种的脂质组成和氧化稳定性。我们使用脂质组学和GC-MS定量来比较和分析脂质。此外，测试OXITEST分析以鉴定和比较这些花生栽培品种的氧化稳定性。

重要的是要注意，还进行了脂质和氧化稳定性的联合分析，以确定脂质结构与花生氧化稳定性之间的潜在关联。澄清这些信息可能对油籽的生产，储存，营养选择和经济效益产生重大影响。

2、材料和方法

2.1. 植物材料和化学品

研究中使用的13个花生品种由四川省农业科学院工业作物研究所提供。品种在正常生长条件下在成都市实验田金塘县(中国四川省)种植4个月(图1)。使用的花生品种是詹 jinag2，中华6号，合玉11号，合玉12号，富花14号，吉花13号，吉花16号，玉华37号，月友45号，吉花836号，开农71号，开农1768号和开农1760号。收获时，将坚果去皮，脱壳，研磨成粉末，并在t 80℃下储存?C直到使用。

图1、13个花生品种的表型。

高效液相色谱(HPLC)级甲醇，乙腈，异丙醇，乙酸铵，甲基叔丁基醚(MTBE)购自Sigma Aldrich(Saint Louis，MI，USA)。氢氧化钾，正己烷，三氯甲烷，十七烷酸购自阿拉丁(中国上海)。

2.2. GC-MS分析和鉴定脂肪酸甲酯

GC-MS分析通过报道的方法进行了一些修改[19,20]。将花生粉(0.5g)置于含有5mL正己烷的falcon管中。加入十七烷酸作为内标并旋转30秒。加入约2mL 5mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，旋转1分钟，然后离心10分钟。将上清液转移至加入新管，加入等体积的无菌蒸馏水以清洁提取物。离心(10000rpm，15分钟)后，在分析之前将上清液通过膜(孔径0.22μm)过滤。使用25:1分流进样口将1μL等分试样的样品注入SH-Rxi-5Sil MS毛细管柱(Shimadzu，Kyoto，Japan)。GC进样器，离子源，传输线和检测器温度为280?C、 230?C、 235?C、 和230?C、 分别。烤箱温度编程如下：170?C 2分钟，220?C的速度是20?C/min，240?C的速度是50?C/min，240?C 2分钟，280?C的速度是10?C/min，280?C进行5分钟。每次分析需要18分钟。使用标准Supelco 37组分FAME混合物(Supelco，Darmstadt，Germany)和质谱数据库搜索(NIST 14文库)鉴定脂肪酸甲酯(FAME)。根据不同FAME峰面积与内标(15:0)峰面积的比率计算FAME的浓度。脂肪酸组成表示为浓度(mg/g花生)。分析一式三份进行。

2.3. OXITEST分析

根据已发表的报告[21]，使用OXITEST反应器(Velp Scientifica，Milan，Italy)进行OXITEST分析。简而言之，将15g花生粉均匀地涂布在室内的两个样品盘上。室温设定在90℃，初始氧气压力为6.0巴。当反应时间超过200小时或氧气压力小于1.5巴时，监视器自动停止。诱导期(IPs)，以分钟表示，采用双切线法获得，该方法是获得氧化稳定期和氧化稳定期氧化曲线切线交点的方法

氧化诱导期。IP越长，随着时间的推移抗氧化稳定性越高。

2.4. 非靶向脂质组学分析

2.4.1. 脂质提取

使用Linhong Jiang方法提取总脂质[22,23]。将甲醇(150μL)和MTBE(450μL)加入到含有六个干净研磨珠的2mL组织研磨管中的35.0mg花生粉中。高速摇动后，加入300μL25%甲醇/H2O溶液并超声处理10分钟。将混合物以11000rpm离心10分钟，并将有机相在氮气流下干燥并储存在t 80℃。

2.4.2. 仪器和方法

对于UPLC-Q-TOF-MS分析，将干燥的样品重新溶解在400μL乙腈/异丙醇/H 2 O(6.5/3.0/0.5，v/v/v)中。然后将100μL悬浮液转移至插入管(Agilent，Santa Clara，America)。该分析在UPLC系统(Acquity，Waters，Worcester，America)中进行，该系统配备有Acquity UPLC HSS T3柱(1.8μm，2.1×100mm;Waters，Worcester，America)和Xevo G2-S Q-TOF质谱仪。(Waters，Worcester，America)。流速为0.4mL/min。

流动相A由乙腈/水(40:60，v/v)组成，而流动相B为乙腈/异丙醇(10:90，v/v)，两者均含有10mM乙酸铵。洗脱梯度如下：0-3分钟，40-70%B;3-15.5分钟，70-95%B;15.5-19分钟，40%B。柱温保持在55℃。，样品室温度保持在7℃。，注射体积为5μL。在质谱分析中使用正离子和负离子模式。质谱参数设定如下：源温度120?C;毛细管电压，2.0 kV;

锥形气体，50升/小时;在550℃下为900 L/h。;采样锥电压，30 kV;MS扫描范围为全离子和全离子碎片扫描模式下的50–1200 Da。

2.4.3. 数据处理和分析

使用LipidSearch(版本4.2，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)进行数据分析和脂质鉴定。首先，将原始数据传输到DataExplorer，并使用前体公差(±5 ppm)，产品公差(±5 ppm)和通用数据库确定峰。其次，数据与峰值对齐，峰值强度校正如下：t分值0.5，面积分值≥ 0.7，重复等级=1，ap值<0.05。ID质量过滤器被选为A，B和C级。LipidSearch软件生成的所有脂质注释都是通过将分子组成，保留时间(RT)和特定碎裂行为与lipid MAPS free数据库中的脂质标准进行比较来手动验证的(http://www.lipidmaps.org(访问于2020年7月10日))。

2.5. 统计分析

使用Mi  crosoftExcel 2016软件和IBM SPSS Statistics 24.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)计算平均值，标准偏差和显着水平。独立样本t检验用于检验高OA和非高OA花生之间脂质水平的差异，p<0.05。使用SIMCA 13.0软件(Umetrics Inc.，Malmo，Sweden)进行主成分分析(PCA)，偏小二乘判别分析(PLS-DA)，以及显着变化的脂质的投影变量重要性(VIP)>1,2)。作为经典的线性降维技术，PCA(无监督)和PLS-DA(监督)旨在在小二乘重建误差的意义下获得高维数据的紧凑表示[24,25]。使用GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad software Inc.，San Diego，CA，USA)，Origin 2019b软件(OriginLab Inc.，Northampton，MA，USA)和TBtools 1.075软件[26]绘制图表。

3.结果

3.1. 脂肪酸的鉴定和定量进行GC-MS分析以了解不同花生品种中游离脂肪酸的组成。在此，16种酰基脂肪酸在脂质谱中表征(表S1)，并且C19具有高的分子种类多样性。Jihua16，Jihua13，Kainong1768，Kainong1760，Yuhua37和Kainong71的OA含量超过100 mg/g花生粉，占总脂肪酸的66.43%。然而，Zhanjiang2，Zhonghua6，Heyou11，Heyou12，Fuhua14，Yueyou45和Guihua836的OA含量低于45 mg/g花生粉，占总脂肪酸的26.40%。为了进一步分析，由于其OA含量的显着差异，将品种分为高和非高OA两组。高和非高OA组的亚油酸含量分别占总脂肪酸的66.43和42.14%。圆形热图显示高OA组聚集在外面，而非高OA组聚集在热图内。这些结果表明，除了亚油酸和棕榈酸之外，高OA花生组积累了14种脂肪酸中的更多(图2a)。选择具有更好脂质性能的高OA组用于进一步的组间比较。

图2、13个花生品种的脂肪酸(FA)谱。(a) 高OA花生品种和非高OA花生品种FA含量的热图。红色(1的比例)和蓝色(f 1的比例)分别表示增加和减少的水平。(b) 热图显示6个高OA花生品种FA含量差异。(c) 高OA花生品种总酰基FA和总不饱和酰基FA的含量。OA，油酸。

高OA组有来自三个品种系列(吉华，玉华，开农)的六个亚品种(H13，H16，H37，H71，H1760和H1768)。高OA组的热图显示H16(吉华)，H13(吉华)和H1768(凯农)具有丰富的脂肪酸，而H71(凯农)和H37(玉华)的脂肪酸水平相对较低(图2b))。样品排序为H16(吉华)>H13(吉华)>H1768(凯农)>H1760(凯农)>H37(玉华)>H71(凯农)，考虑到高至低的总脂肪酸和总不饱和脂肪酸含量(图2c)。因此，这些结果表明OA和亚油酸是花生中脂肪酸的主要成分，占总脂肪酸的66%以上。由于OA的有益功能和更丰富的脂肪酸含量，高OA组，特别是吉华系列的H16和H13，比非高OA花生具有更高的营养价值。

3.2. OXITEST分析

OXITEST仪器进行氧化稳定性分析并确定13种不同花生品种的氧化曲线和IP值(图3a-c)。高OA花生的平均IP值比非高OA花生(28.4±6.0)高5.2倍(147.7±29.0 h)。在高OA组中，H16(吉华)，H13(吉华)和H1768(凯农)是氧化时间长(超过170小时)的前三大品种。这些结果表明，高OA花生具有较好的氧化稳定性，表明OA高的花生保质期更长，应用空间更广，经济价值更高。

不同的高OA品种具有不同的氧化稳定性，吉华系列品种具有氧化稳定性。

图3。OXITEST氧化试验反应器对13个花生品种的氧化稳定性。(a，b)基于OXITEST数据的15 g非高OA花生品种和90℃高OA花生品种的耗氧量曲线。OA，油酸。(c) 散点图显示非高OA花生品种和高OA花生品种的氧化诱导期(IP)。

3.3. 在花生中产生脂质谱

该研究使用经典方法在METB提取后提取脂质。该方法使用包括甘油磷脂，鞘脂和糖脂在内的五种内标显示出良好的脂质回收率，回收率为87.1-98.9%[27]。这个

通过混合20μL所有单个样品获得的质量控制样品(QC)的聚类确定了分析程序的稳健性。QC在整个序列中聚集在PCA绘图中心附近，表明数据采集的高质量(图S1)。

在PCA模型中，这13个品种根据倍性程度聚集成两个主要组，从而证实了在初步组中观察到的样品聚类(图4a)。正模型和负模型下的样本数据是可靠的，因为

拟合优度X[1](R2X[1])和R2X[2]的总和解释了总方差的55%以上。同时，构建了像OPLS-DA这样的监督模型，以突出样本之间的差异。PLS-DA得分图显示了在正电离和负电离模式下模型的优异质量，因为R2超过总方差的60%(图5ab)，因此验证了模型。

图4。在13个花生品种中检测到脂质组学谱。(a) 13个花生品种的PCA评分图。(b) 主要脂质谱的含量。(c) 甘油三酯分布。(d) 二酰基甘油分布图。(e) 甘油磷脂分布图。(f) 热图显示高OA花生品种和非高OA花生品种之间ARA结合脂质分子的含量差异。ARA，花生四烯酸;OA，油酸。

该研究确定了229个同时匹配偶联串联MS文库(MS2)的脂质特征(表S2)。在229157个脂质特征中，在正电离模式下检测到72个在负电离模式下检测到72个。常见离子，选择为

一个代表性的例子，在相应的光谱上得分为714.5075(PE 16:1/18:1)(图S2)。识别m/z 714.5075可以从特征碎片离子中解释。离子m/z 281.2483表示18:1脂肪酸链，离子m/z 253.2173表示16:1脂肪酸链，从sn-1和sn-2位置的甘油酯键断裂。在这些花生品种中检测到超过25个脂质家族(图4b)。花生样品中的主要脂质家族是甘油三酯(TG)，甘油二酯(DG)，磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。花生样品中的平均TG，DG和PC含量分别占总脂质的74.74%，10.85%和7.81%。TG含量对总脂质积累的影响大，占总脂质含量的70%以上。

图5。与非高OA花生品种相比，高OA花生品种中鉴定的不同表达脂质的分布。(a，b)分别在阳性和阴性扫描模式下脂质种类的PLS-DA评分图。(c，d)分别在阳性和阴性扫描模式下PLS-DA中各个脂质的VIP评分。(e) 高OA花生品种与非高OA花生品种的C18:1上调脂质种类。(f) 在高OA花生品种与非高OA花生品种的概况中用C18:2下调脂质种类。星号表示显着性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

该研究进一步分析了TG，DG和PC谱中脂肪酸种类的组成。花生和几种具有不饱和脂肪酸链的具代表性的物种合成了约200个TG，20个DG和20个PC(图4c–e)。在高OA花生中，TG(18:1/18:1/18:1)，TG(18:1/18:1/20:4)和TG(18:0/18:1/18:1)。高OA花生中三种TG种类显着高于非高OA花生(p<0.05)。然而，非高OA中突出的TG物种是TG(18:2/18:2/18:2)，TG(20:0/18:2/20:5)和TG(22:0)/18:2/20:5)，显着高于高OA花生(p<0.05)。此外，DG(18:1/18:1)，DG(18:3e/18:1)和PC(18:1/18:1)是高OA花生中突出的DG和PC物种。在非高OA花生中，主要的DG和PC概况是DG(18:2/18:2)，DG(16:0/18:2)和PC(19:1/18:2)。另外，ARA(C20:4)是掺入TG中的常见的脂肪酸。具有ARA的TGs热图表明，较高比例的含ARA的脂质分子积聚在高OA花生中(图4f)。TG，DG和PC与OA和ARA的含量在高OA中比非高OA花生增加。

3.4. 高OA和非高OA花生分化的统计分析

使用SIMCA软件中的PLS-DA模块和TBtools软件中的热图模块进行统计分析。PLS-DA模型根据可用的脂质对不同类型的花生进行分类。根据前两个主成分对高OA和非高OA花生进行分类，正负扫描模式下的累积贡献率分别为62.8%，61.6%(图5a，b)。在阳性和阴性模式下总共51和31种脂质种类变量显着促成VIP(>1)(图5c，d)。16种不同表达的脂质(12种脂质与OA)上调，66种(39种脂质与LA)在高OA中比非高OA组下调。

进一步分析评估了碳原子C 18:1和C 18:2的脂质种类的相对强度变化。大约75%的上调脂质是C 18:1结合的脂质，59%的下调脂质是C 18:2结合的脂质(图5e，f)。此外，11种脂质(VIP>2)是正离子和负离子下高OA和非高OA花生组之间的指标。其中，六种脂质(TG 18:2/18:2/18:2，TG 24:0/18:2/18:3，TG 20:5/14:1/18:2，TG 18:2/具有碳原子C 18:2的14:1/18:2，PE 17:0/18:2，BisMePA 18:2/18:2)和多不饱和脂质(PG 38:5)也显示含量降低。其他四种脂质(PMe 18:1/18:1，PC 18:1/18:1，MGDG 18:1/18:1，TG 10:0/10:1/18:1)更丰富在高OA花生中。总之，这些脂质分子的含量在两个花生组之间表现出不同的模式。具有C 18:1的脂质被上调，而具有C 18:2的脂质被下调。

澄清了高OA花生和非高OA花生之间脂质组成的差异。高OA花生品种间脂质组成的分析显示高OA花生中有7种富含代表性的功能性脂质类别(图S3a)。热图显示H37(玉华)，H71(凯农)和H13(吉华)含有高含量的CL，PS，PI，PC，PE和DG，这些脂质对人体健康很重要。

TG是一个主要的健康危险因素，消耗高于正常水平可能诱发心血管疾病，如动脉粥样硬化[28]。热图显示H1768(Kainong)中TG的含量相对较低，但在H13(Jihua)，H37(Yuhua)和H71(Kainong)中上调(图S3b)。这些结果证明了高OA花生品种之间脂质组成的差异。使用UPLC-Q-TOF-MS的脂质组学可能评估质量并鉴定不同的花生品种。

4。讨论

花生是一种经济上重要的富含油脂的作物，脂质氧化稳定性对评估花生品质很重要。将具有两个独立氧化室的OXITEST反应器连接到氧气罐和具有VELP OXISoft软件[29]的测试计算机以测量花生氧化稳定性。该仪器的优点是它可以直接测量整个食品的氧化稳定性，而无需样品预处理即可进行脂质分离。该装置指示自动氧化过程的诱导期，速率和加速度，以及产品消耗的氧气总量。该反应器还进行新鲜度测试，配方比较，包装比较和估计保质期，广泛用于食品工业[30]。因此，该研究使用OXITEST反应器来测试脂质氧化稳定性。

当OA含量>60%，亚油酸含量<3%时，花生品种的IP值超过110 h。然而，当OA含量<30时，花生品种的IP值<40 h%和亚油酸含量>40%。因此，氧化稳定性与OA含量成正比，与亚油酸成反比，与先前的研究一致[31,32]。除游离脂肪酸外，该研究还分析了其他脂类与氧化稳定性之间的关系。各种物质，包括DG，LPC，PC，PS和TG，与氧化稳定性呈负相关(图S3c)。该观察结果与Mitchell和Stephanie[33,34]的报告一致，该报告表明该物质由于其高度不饱和的含量而易于氧化。脂质组成影响脂质氧化，营养价值和其他性质[35,36]。因此，了解花生脂质成分对改善其应用至关重要。

GC-MS鉴定出16种游离脂肪酸。比以前的研究确定了更多的脂质种类，可能是由于我们使用的分析方法不同[37]。值得注意的是，高OA花生的OA含量远高于花生的平均含量(43.15%)[38]。此外，研究发现，通过脂肪酸分析，高OA和非高OA花生品种的OA和LA含量存在显着差异。

本研究采用脂质组学方法比较了脂质数据库中UPLC-Q-TOF-MS的主要特征后13个花生品种的品质。结果确定了13个花生品种中229个脂质的27个亚类。脂质组学

显示高OA花生品种的脂质组成差异。因此，本研究证实脂质组学可广泛用于食品分析，可能是品种鉴定和食品质量分析的主要工具。然而，该研究受到样本量小和未优化的脂质组学方法的限制，这可以在未来的研究中得到解决。

5。结论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS，脂质组学和游离脂肪酸分析法测定了13个花生品种的脂质组学特征和游离脂肪酸，并比较了它们的脂质组成。此外，OXITEST分析阐明了不同花生品种的脂质氧化稳定性。因此，高OA花生的脂质组成优于非高OA花生，尤其是OA含量。同时，由于脂质不饱和度适中，高OA花生的氧化稳定性明显优于非高OA花生，这意味着货架期较长。此外，脂质组成

高OA花生品种的种类各不相同，11种脂质分子分别是鉴定高OA和非高OA花生品种的潜在指标。这些研究结果为开发和利用不同的花生品种提供了基础知识，揭示了脂质组学作为食品质量评估新工具的应用前景。

补充材料：以下内容可在线访问：https://www.mdpi.com/article/10.3390/foods11010004/s1，图S1：分别基于阳性和阴性扫描模式下质量控制(QC)的质谱数据的PCA得分图。图S2:PE(16:1/18:1)的M/z 714.5073处[M+H]+的MS/MS谱和碎裂途径。图S3：(a)多种功能性脂质的热图。CL，心磷脂;PS，磷脂酰丝氨酸;PG，磷脂酰甘油;圆周率，

磷脂酰肌醇;PC，磷脂酰胆碱;PE，磷脂酰乙醇胺;DG，甘油二酯。(b) 甘油三酯(TG)的热图。(c) 脂质和氧化稳定性一致性分析的热图。IP，诱导期。星号表示显着性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。表S1：不同花生品种中的脂肪酸含量。表S2：不同的脂质组成花生品种。

作者贡献：方法论，数据策划，软件，可视化，写作-原稿准备，Y.H。;形式分析，验证，R.M。;资源，概念化，Y.X。;写作-评论和编辑，K.Z。;调查，监督，资金收购，Q.B。;项目管理，H.G。所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。

资金来源：本研究由四川省科技厅重点研究发展计划(no.2020YFS0570)资助。利益冲突：作者声明没有利益冲突。

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